[微生物利用甘油生产二羟基丙酮的研究]

微生物利用甘油生产二羟基丙酮的研究 轻工技术与工程 2111805077** 摘要：甘油可以参与氧化、酯化、硝化、醚化、胺化和卤化等多种化学反应，将廉价的甘油转化为高附加值的化工产品。二羟基丙酮由于具有较高的附加值，有较大的市场需求，己成为甘油转化研究的热点。微生物利用生物柴油副产品甘油生产DHA是可行的，本文研究了包括生物柴油副产品甘油中离子对弗托氏葡糖杆菌CGMCC5397生产DHA的影响及甘油的预处理。最后对发酵培养基进行了优化，并进行7L罐分批和补料发酵研究。

关键词:甘油；
1,3-二羟基丙酮；
微生物法 1 前言 微生物能够利用生物柴油副产品甘油生产甲醇、丙二醇等己被研究，同样利用生物柴油副产品甘油生产DHA也是可行的，但生物柴油副产品甘油中含有金属离子，毒性有机物等可阻碍或抑制甘油脱氢酶活性，从而导致微生物不能利用甘油生产DHA，为消除这些影响，必须对生物柴油副产品甘油中有害物质进行研究，并建立一套简单处理方法除去生物柴油副产品甘油中毒性物质，使微生物能有效利用其生产DHA。

2 二羟基丙酮概况 2.1 DHA的理化性质 1,3-二羟基丙酮(1,3-dihydroxyacetone)或称为羟基丙酮(dihydroxyacetone)，简称DHA,是自然界存在最简单的三碳酮糖，它具有甜、凉的味道，外观为白色或类似白色的粉末状结晶，空气中放置容易吸湿，吸湿后容易分解。1,3-二羟基丙酮是一种重要的化工制造原料，是合成医药、农药等方面的重要中间体和多功能食品添加剂，其用途很广泛。

2.2 甘油及其应用 甘油作为基本化工原料，广泛应用于多个行业近2000多个产品。各行业使用比例为医药6%，化妆品5%，烟草6%，涂料36%，牙膏35%，其他12%。甘油可以参与氧化、酯化、硝化、醚化、胺化和卤化等多种化学反应，将廉价的甘油转化为高附加值的化工产品。在一定条件和催化剂作用下甘油经选择性氧化生成甘油酸和二羟基丙酮。经脱水生成丙烯醛，经发酵或氢解生成1，3-丙二醇、经氢解生成1，2一丙二醇、经重整生成合成气以及碳酸甘油和缩水甘油等。其中二羟基丙酮由于具有较高的附加值，有较大的市场需求，己成为甘油氧化转化研究的热点。甘油有两种不同的羟基结构，而这种结构使其易被氧化，然而不同的反应条件或者催化剂对两种羟基选择性不同。将甘油作为原料进行下游产品生产的主要过程如图1所示。

2.3 DHA应用 (1)二羟基丙酮分子中含有三个官能团，化学性质活泼，广泛参与诸如聚合、缩合等各种化学反应，是一种重要的化学合成的中间体，也是一个重要的多功能试剂，如能有效地参与从甲醛到羟醛、羟酮的缩合反应。

(2)二羟基丙酮广泛应用于化妆品中，二羟基丙酮能阻止皮肤水分的过度蒸发，对皮肤起到保湿和防晒作用。二羟基丙酮又是一种良好的着色剂，试验发现，含有二羟基丙酮的乳液涂抹在皮肤上可与皮肤表面的氨基酸反应，不需晒太阳就可以产生古铜色的皮肤。二羟基丙酮还可以作为良好的白瘫风遮盖剂。在制革工业中，二羟基丙酮也可作为皮革制品的保护剂。

（3)二羟基丙酮是一种重要的医药中间体和药物，现已应用于低血糖和糖尿病及某些皮肤病的治疗。此外，以1,3一二羟基丙酮衍生物为中间体合成的一些化合物表现出一定的抗病毒活性，如抗艾滋病病毒等。

（4）应用于食品行业。被尝试作为保健和功能性食品添加剂,并且DHA具有特殊甜味，有人用其作为一些食品的风味添加剂和食品果蔬的。具有抗肥胖作用，补充DHA能够有效地促进人体脂肪的分解并抑制脂肪合成。

3 实验材料与方法 3.1实验材料 3.1.1 实验菌种 供试菌种:由本实验室筛选出菌种:弗托氏葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter frateurii)HD924，中国微生物菌种保藏中心保藏号:CGMCC 5397 3.1.2 培养基 斜面培养基(g/L):甘油50，酵母粉15,KH2P043，琼脂20,pH 6.0 一级种子培养基(g/L):甘油50，酵母粉15 , KH2P043 , pH 6. 0 二级种子培养基(g/L):甘油30，酵母粉10, KH2P043 ,pH 6.0 发酵培养基(g/L):甘油100，酵母粉10, KH2P043,pH 6.0 发酵罐补料发酵培养基(g/L）:甘油20，玉米浆15 , KH2P043 ,pH 6.0 以上培养基均121℃,20 min高压蒸汽灭菌。

3.1.3 其他材料 （1）生物柴油副产品甘油来源及性质 生物柴油副产品甘油，以地沟油为原料油通过酯交换工艺制成长链脂肪酸和甘油，甘油含量为53%，各种离子含量分别为SO42-4.39%、Mg2+53 ppm、Zn2+1848 mg/L、Ca2+ 2800 ppm、K+ 315 ppm、Fe2+1730 ppm、Fe3+1800 ppm、 Cl-4800 ppm、pH 1.1。

（2）生物柴油副产品甘油预处理 10 mol/L氢氧化钠调节pH为7.9，沉淀8 h，抽滤，滤液分别过732阳离子交换树脂，D315阴离子交换树脂，流速为2 mL/min，稀释为10%甘油含量溶液待用。

（3）摇瓶发酵 取冷冻管保藏菌株接于装液量为30 mL一级种子培养基的250 mL锥形瓶，30℃,220 rpm摇床培养24 h, 5%接种量接二级种子，同上条件培养9h，接装液量为30 mL发酵培养瓶，培养48 h，测DHA含量。

3.2 分析检测方法 ①DHA检测方法:本文选取分光光度法和液相两种方法测定发酵液中DHA含量。

②甘油检测方法:采用HPLC法测定甘油含量。测定条件同DHA，检测器为RI检测器。

③菌体量测定方法:采用比浊法，菌液用2%稀盐酸稀释10倍后在560 nm处测定吸光值。

4 结果与讨论 4.1 不同离子对弗托氏葡糖杆菌转化生产DHA的影响 以纯甘油为碳源，按照摇瓶发酵培养基成份配制培养基，另外配制培养基时以生物柴油副产品甘油中各种离子含量比例分别加入相应的无机盐配制成含有不同离子的发酵培养基，摇瓶培养条件培养48 h，测各物质含量。

表1 不同离子对发酵生产DHA影响 Fe3+、Fe2+、SO42-、Ca2+、Zn2+对菌体生长均有抑制作用，特别是Zn2+几乎完全抑制菌体生长及转化甘油。由此见，要使弗托氏葡糖杆菌利用甘油生产DHA，必须对甘油进行预处理，除去其中的金属离子和毒性有机物质。

图2 Zn2+ 、SO42-不同浓度对发酵生产DHA的影响 图3 Fe3+、Fe2+不同浓度对发酵生产DHA的影响 Zn2+含量升高，菌体量和DHA浓度呈现先缓慢升高，当浓度大于100 mg/L时DHA生成量迅速降低， Fe3+、Fe2+ 、SO42-随着发酵液离子浓度的升高，DHA浓度逐渐降低。

4.2 生物柴油副产品甘油预处理对生产DHA的影响 调节pH7.9使Fe2+ Fe3+及一些酸性蛋白、杂质充分沉淀，抽滤除去沉淀物，通过离子交换树脂除去其他一些离子及可溶性蛋白。每步处理后，取此步处理后甘油配制发酵培养基，摇瓶发酵后测DHA。

表2 不同处理对DHA生产影响 甘油中离子强度逐渐降低，经732阳离子交换树脂处理后离子强度为3278 us/cm，降低了97%，处理后甘油按发酵培养基组分配制，摇瓶发酵后，DHA含量由未处理时的不产DHA提高到72 g/L。

4.3 不同氮源对发酵生产DHA的影响 图4 不同氮源对发酵生产DHA的影响 该菌对硫酸按，硫酸钾，尿素等无机氮源的同化能力较差，该菌对牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、玉米浆等同化能力较好，以此作氮源能有效促进菌体生长和DHA合成。以玉米浆为氮源的DHA产量最高达75.63 g/L，酵母膏和牛肉膏次之，分别为69.4 g/L和61.6 g/L。

4.4 初始甘油浓度的影响 图5 不同甘油浓度对发酵DHA的影响 当甘油浓度为20 g/L时，生物量最大为9.23，由于甘油浓度过低，转化生成DHA浓度很低，随着甘油浓度不断增加，DHA产量不断变大，而菌体量趋于平衡，当甘油浓度为100 g/L时DHA达到最大70.87 g/L。随着甘油浓度不断增加，高浓度底物甘油及有毒金属离子浓度增大，菌体生长受到抑制，菌体量不断降低，DHA产量也不断降低。

4.5 处理后生物柴油副产品甘油与纯甘油发酵罐分批发酵比较 在摇瓶发酵的基础上，纯甘油和处理后生物柴油副产品甘油在7L发酵罐中分批发酵实验。初始甘油浓度为100 g/L,30℃下，通气量为2vvm，发酵48h。

图6 生物柴油甘油和纯甘油7L发酵罐分批发酵生产DHA 菌体在32 h时生长达最大，发酵结束时DHA浓度为77.2 g/L。纯甘油发酵时，菌体增长与生物柴油副产品甘油相似，最大菌体量略高，发酵结束后DHA浓度为88.9 g/L。甘油剩余量只有5.9 g/L。表明生物柴油副产品甘油中可能仍含有一些有毒物质，抑制DHA合成。为降低抑制作用可进行分批补料发酵。

4.6处理后生物柴油副产品甘油补料分批发酵 在分批发酵的过程中，底物的抑制作用是影响弗托氏葡糖杆菌转化生产DHA的主要因素，因此在发酵过程采取补料分批发酵，即初始底物浓度较低，一段时间后加入一定量底物，使底物一直保持在一个相对较低的浓度，这样菌体就能快速生长，并且稳定期得到延长，底物抑制作用降低，转化效率提高。

图7 生物柴油副产品甘油补料分批发酵生产DHA 经过48 h，生物量达到最大8.37，发酵结束后DHA产量为87.1 g/L,，比分批发酵提高22.9%。

4.7棕榈油生物柴油副产物甘油来源分批及补料分批发酵 棕榈油生产生物柴油副产品甘油进行补料分批发酵且金属离子和杂质较少。

图8 棕榈油生物柴油副产品甘油补料分批发酵 发酵前8h，菌体量迅速增加，并于8h达到最大，发酵48h后，DHA产量达到125.8 g/L。由此可知，棕榈油生物柴油副产品甘油进行分批补料发酵生产DHA时，杂质对菌体生长抑制较弱，DHA能得到高效生产。

5 讨论与展望 （1） 本文对生物柴油副产品甘油用于微生物发酵生产DHA的可行性的研究，通过对甘油性质的研究发现，其本身pH过低，离子强度过大，尤其是Zn2+对菌体的生长及转化的抑制非常明显，不适合进行生产DHA。

（2）通过一定方法预处理后，生物柴油副产品甘油可以进行微生物转化生产DHA。通过对不同氮源，及初始甘油浓度的研究可知最适氮源为玉米浆，最佳初始甘油浓度为100 g/L。

（3）选取棕榈油生物柴油副产品甘油分批补料发酵时，甘油杂质较少，转化高效，最终DHA产量能达到125. 8 g/L。

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